In-situ produktie van bacteriocines als bioconserveringsmethode

Verslag literatuuronderzoek
Arjon Beulens
Wageningen Universiteit, Wageningen

SAMENVATTING

Uitvindingen in de geschiedenis hebben de mens de mogelijkheid gegeven om voedsel op te slaan en zodoende op één plaats te blijven leven. Het conserveren heeft veel veranderingen ondergaan en ook nu is men nog steeds op zoek naar andere en betere manieren. De consument wil een meer natuurlijke manier van conserveren, zoals het aloude fermenteren door melkzuurbacteriën. Zodoende is de interesse in deze micro-organismen gegroeid en dan vooral de bacteriocines, de anti-microbiële verbindingen, geproduceerd door melkzuurbacteriën. Nisine is een van die verbindingen. Nisine kan een breed spectrum van Gram-positieve micro-organismen vernietigen en is niet toxisch voor de mens en kan zodoende toegepast worden in de voedingsmiddelenindustrie.
In dit verslag is onderzocht of het mogelijk is om voedsel te conserveren m.b.v. in-situ-produktie van bacteriocines. Hierbij komen een aantal factoren kijken zoals stabiliteit en produktiecapaciteit.
Uit experimenten betreffende stabiliteit is naar voren gekomen dat nisine gevoelig is voor de pH. Een goede activiteit is waargenomen bij pH=2.0. Dit nam af bij pH=8.0 en er was geen activiteit meer bij een pH van 11.0. De activiteit nam niet af bij hogere temperatuur. Nisine is thermostabiel, zoals de meeste bacteriocines. Uit onderzoek is verder gebleken dat er enzymen zijn, die in staat zijn tot het splitsen van het bacteriocine.
Nisine wordt geproduceerd door Lactococcus lactis ssp. lactis. Tijdens een pH-vrije batchfermentatie is de produktie van nisine onderzocht. Hierbij werd na ongeveer 8 uur een nisineproduktie bereikt van 1500 IU/ml. Dit is waarschijnlijk voldoende voor een goede afdoding. Onderzoek heeft aangetoond dat er ongeveer 2000 IU nodig moet zijn om een afdoding te krijgen van 10 3 tot 10 7 .
De suikerconcentratie blijkt niet van grote invloed te zijn op de nisineprodukte, hoewel de concentratie hoger moet zijn dan 5.0 g/l om een goede produktie te verkrijgen. Uit onderzoek na verschillende suikers blijkt de produktie beter te verlopen op een disaccharide als koolstofbron.
Tevens is gekeken hoe de produktie zich verdraagt onder koolstof-, stikstof- en fosfaatlimitatie. Onder alledrie de limitaties daalt de produktie ongeveer het drievoudige.
Uiteindelijk is bekeken of het mogelijk is om de in-situ produktie van bacteriocines toe te passen als bioconservering. Hierbij is gekeken na de aspecten die een rol spelen. Het blijkt dat de mogelijkheden aanwezig zijn vooral bij melkprodukten en in mindere mate bij vlees- en visprodukten. Dit door een aantal negatieve eigenschappen van vlees.

INHOUDSOPGAVE

1. INLEIDING 4
2. NISINE 5
3. STABILITEIT VAN NISINE 6
3.1 pH-stabiliteit 6
3.2 Warmtestabiliteit 6
3.3 Stabiliteit na behandeling met enzymen 6
4. PRODUKTIE VAN BACTERIOCINES 8
4.1 Produktie van nisine 8
4.1.1 pH-vrije batchfermentatieprocessen 8
4.1.2 Schijnbare trofofase/idiofase-kinetiek en pH-regulatie van de nisinebiosynthese 9
4.1.3 Invloed van verschillende koolstofbronnen op groei en nisineproduktie 10
4.1.4 Groei en nisineproduktie onder limitaties 11
4.2 Produktie van amylovorine 12
5. BIOCONSERVERING DOOR IN-SITU GEPRODUCEERDE BACTERIOCINES 14
5.1 Bioconservering in melkprodukten 14
5.2 Bioconservering in vleesprodukten 14
6. CONCLUSIE 16
LITERATUURLIJST 17

1. INLEIDING

Een van de belangrijkste gebeurtenissen in de geschiedenis is de mogelijkheid van de mensheid om zijn voedsel op te slaan en lang(er) te bewaren dan voorheen. Door deze bevindingen is het mogelijk geworden om een voorraad aan te leggen en zodoende voedsel voor langere tijd te garanderen. Vroeger gebeurde dit voornamelijk door inzouten, drogen en fermenteren. Later, in 1864 bewees Louis Pasteur dat de micro-organismen de oorzaak waren van voedselbederf, dat hittebehandeling deze organismen kon doden en dat bewaren na verhitten in een gesloten systeem, zoals potten, herbesmetting kon voorkomen. Nog veel later kregen de meeste mensen koelkasten thuis tot hun beschikking en was het opslaan van voedsel een gewoon gebeuren. Ondanks de vele technieken die tegenwoordig toegepast worden, zijn er veel consumenten niet tevreden. De consument wil meer natuurlijke produkten en is bezorgd over de grote hoeveelheden chemische stoffen die gebruikt worden bij voedselconservering. Veel van de voedselconservering gebeurt nog met gebruik van nitriet, sulfiet en organische zuren. Bioconservering is de natuurlijke manier van conserveren. Fermentatie is zo'n natuurlijke methode van conserveren en melkzuurbacteriën spelen hierin een belangrijke rol. Daarom komen tegenwoordig de verschillende melkzuurbacteriën en de natuurlijke anti-microbiële verbindingen, geproduceerd door de melkzuurbacteriën, meer en meer onder de aandacht als vervanger voor synthetische conserveringsmiddelen en een van deze verbindingen is nisine (Y. Friedman, 23/1/99), (Stiles, 1996).
In het volgende verslag komen de verschillende aspecten van nisine aan de orde. Zodoende kan worden nagegaan of in-situ produktie van nisine een optie is om in de toekomst misschien als natuurlijk conserveringsmiddel te dienen voor verschillende produkten, zowel gefermenteerd als ongefermenteerd.
In hoofdstuk 2 wordt kort ingegaan op bacteriocines en dan voornamelijk nisine.
In hoofdstuk 3 wordt de stabiliteit van nisine besproken. In paragraaf 1 wordt de stabiliteit besproken bij verschillende pH's. De stabiliteit wordt vergeleken door middel van de aanwezige activiteit bij drie verschillende pH's. Dit wordt vervolgens ook bij verschillende temperaturen gedaan in paragraaf 2 en in paragraaf 3 wordt de activiteit besproken na behandeling met verschillende toepasselijke enzymen.
In hoofdstuk 4 worden verschillende aspecten van de groei- en produktiekinitiek besproken. In paragraaf 1 van dit hoofdstuk wordt dit gedaan voor nisine en in paragraaf 2 voor amylovorine, een bacteriocine geproduceerd door Lactobacillus amylovorus .
In hoofdstuk 5 tenslotte wordt tenslotte nagegaan of in-situ produktie van bacteriocines een reële optie is als bioconserveringsmethode.

2. NISINE

Melkzuurbacteriën produceren een grote variatie van metabolieten, waaronder bacteriocines. Bacteriocines zijn anti-microbiële eiwitten, die geproduceerd worden door deze melkzuurbacteriën om een ecologisch voordeel te krijgen. Er is een grote variatie ontdekt aan deze bacteriocines met verschillende kenmerken en variatie in activiteitsspectra (Klaenhammer, 1987). Een overzicht van enkele verschillende bacteriocines is te zien op bijlage I van dit verslag (Abee, 1998).

Nisine is een van deze bacteriocine, dat wordt geproduceerd door de melkzuurbacterie Lactococcus lactis ssp. Lactis. Het heeft een breed activiteitsspectrum en is actief tegen verschillende Gram-positieve bacteriën, zoals de voedselpathogenen: Leuconostoc sp., Clostridium sp., Bacillus sp. en Staphylococcus aureus . Doordat het niet toxisch is voor mens en dier en afgebroken wordt in het maag-darmkanaal is het door de Wereldgezondheidsorganisatie geaccepteerd als conserveermiddel in de voedingsmiddelenindustrie. Nisine wordt tegenwoordig op beperkte schaal toegepast in o.a. de kaasindustrie (Hugenholtz et al , 1991) en vleesindustrie (Stiles and Hastings, 1991). De beperkte toepassing van nisine is enerzijds een gevolg van de relatieve onbekendheid van nisine en anderzijds een gevolg van de beperkingen van nisine, zoals de minder goede oplosbaarheid en beperkte stabiliteit in neutraal en basisch milieu, de ongevoeligheid van (soms pathogene) Gram-negatieve bacteriën voor nisine en de hoge gevoeligheid van de meeste melkzuurbacteriën voor nisine. (Hugenholtz et al ., 1991).

Nisine is een familie van vijf verschillende, sterk verwante polypeptiden, aangeduid als nisine A, B, C, D en E. Deze verschillende nisinevormen verschillen aanzienlijk in biologische activiteit. De biologische activiteit van nisine veroorzaakt door 1 ug van het gestandaardiseerde commerciële nisinepreparaat wordt gedefinieerd als één Reading-eenheid en wordt beschouwd als de internationale eenheid (International Unit, IU). Eén gram zuiver nisine komt zo overeen met 40*E6 IU (De Vuyst, 1990).

Nisine is opgebouwd uit 34 aminozuren. Naast de algemeen bekende aminozuren bevat nisine ook een aantal onbekende aminozuren, zoals dehydroalanine (Dha) en dehydrobutyrine (Dhb). Ook worden er een aantal lanthionine- en b-methyllanthionineresiduen aangetroffen. Zodoende valt nisine in de de klasse van de lantibiotica. (Hugenholtz et al ., 1991).

3. STABILITEIT VAN NISINE

3.1 pH-stabiliteit
De pH-stabiliteit van nisine werd getest bij drie verschillende pH's nl. 2.0, 8.0 en 11.0. De activiteit werd getest door middel van de agardiffusiemethode t.o.v. Micrococcus flavus als testorganisme. Als aangenomen wordt dat de grootste stabiliteit wordt waargenomen bij pH 2.0, dan kan t.o.v. deze waarde een activiteitsverlies gemeten worden. De resultaten zijn weergegeven in tabel 1. Nisine is actief onder zure en neutrale omstandigheden. Dit in tegenstelling tot de meeste bacteriocines geproduceerd door melkzuurbacteriën die onder neutrale omstandigheden inactief zijn (De Vuyst, 1990).


Tabel 1. Stabiliteit van het door L. lactis ssp. Lactis NCFB 894 en NIZO 22186 geproduceerde bacteriocine (De Vuyst, 1990).

Behandeling van celvrij supernatans	% Reductie in inhibitiezonediameter
	L. lactis ssp. Lactis NCFB 894	L. lactis ssp. Lactis NIZO 22186
pH 2.0	0	0
pH 8.0	30	48
pH 11.0	100	100
pH 2.0, 30 min, 121°C, 1.2 bar	15	15
2 mg/ml trypsine; 30 min, 35°C	5	5
2 mg/ml trypsine (10 min 100oC); 30 min, 35°C	0	0
5 mg/ml a-chymotrypsine; 2 h, 25°C	16	14
5 mg/ml a-chymotrypsine (10 min 100°C); 2 h, 25°C	0	0

3.2 Warmtestabiliteit
De warmtestabiliteit werd getest bij pH 2.0. De activiteit werd getest t.o.v. Micrococcus flavus . Het resultaat is weergegeven in tabel 1. Zoals verwacht was er een geringe activiteitsvermindering. Nisine is namelijk thermostabiel, zoals de meeste bacteriocines. Ze zijn echter niet hitte-ongevoelig, omdat het eiwitten zijn en eiwitten gedenatureerd kunnen worden. De thermostabiliteit van nisine zou toe te schrijven zijn aan de thioëtherbindingen.

3.3 Stabiliteit na behandeling met enzymen

Nisine is behandeld met trypsine en a-chymotrypsine, waarbij trypsine en a-chymotrypsine één keer niet en één keer wel hittebehandeld is. Beide testoplossingen samen met een niet-trypsine-behandelde testvloeistof werden 30 minuten geïncubeerd bij 35°C, waarna ze 20 minuten verwarmd werden bij 100°C, teneinde het protease te inactiveren. Na afloop werden de oplossingen op pH 2.0 gesteld met 10 M. HCl. en met het gebruikelijke micro-organisme op activiteit getest. Dit werd herhaald met a-chymotrypsine. De resultaten staan weergegeven in tabel 1. Uit de resultaten blijkt dat trypsine weinig invloed heeft op de activiteit van nisine; a-chymotrypsine had daarentegen duidelijk wel een invloed op de activiteit. Dit is te verklaren door het werkingsmechanisme van beide enzymen. Uit onderzoek van Jarvis en Mahoney in 1969 is verder gebleken dat nisine geïnactiveerd wordt door pancreatine, maar niet door elastase, carboxypeptidase A, pepsine en erepsine. Ook zijn er micro-organismen die nisinesplitsende enzymen of nisinasen produceren, dit zijn Lactobacillus plantarum , Staphylococcus aureus , Streptococcus salivarius ssp. Thermophilus , Bacillus cereus en enkele andere lactobacillen en lactococcen (De Vuyst, 1990).

4. PRODUKTIE VAN BACTERIOCINES

4.1 Produktie van nisine
Nisine wordt geproduceerd door de Lactococcus lactis ssp. Lactis. Het wordt uitsluitend via microbiële fermentatie geproduceerd. Op industriële schaal wordt nisine geproduceerd door batchfermentatie op basis van gesteriliseerde volle, afgeroomde gereconstitueerde of gemodificeerde melk (De Vuyst, 1990).
Om de mogelijkheid te bestuderen of melkzuurbacteriën geschikt zijn om het voedsel houdbaar en microbiologisch veilig te maken, moet onderzocht worden hoe de groei- en produktiekinetiek van melkzuurbacteriën en nisine zich gedraagt. Om de in situ situatie zo veel mogelijk te realiseren is er van een pH-vrije batchfermentatie uitgegaan.

4.1.1 pH-vrije batchfermentatieprocessen
Bij de pH-vrije batchfermentatie trad er eerst een lagfase op van ongeveer 2 uur. Deze lagfase is de aanpassingsperiode van de geënte melkzuurbacterie aan de omgeving. Na deze lagfase treedt er een exponentiële groeifase op van ongeveer 4 à 5 uur met een specifieke groeisnelheid mu van 0.66 h -1 . De celmassaverdubbelingstijd kan hieruit berekend worden volgens:

t x = ln2/mu (Van 't Riet en Tramper, 1991)

De t x heeft dus een waarde van ongeveer één uur; 0.69/0.66. Vervolgens vertraagde de groei om een maximum aan biomassa te bereiken na 8 uur incubatie. Gedurende de fermentatie daalde de pH van een initiële waarde van 6.85 tot 4.29 na 10 h en 4.10 na 24 h incubatie. De pH-daling werd veroorzaakt door de vorming van melkzuur, het belangrijkste eindprodukt van het suikermetabolisme van homofermentatieve melkzuurbacteriën. Volgens de Embden-Meyerhof-Parnas-afbraakroute wordt uit één mol glucose twee mol melkzuur alsook twee mol ATP gevormd. Dit verklaart de inefficiënte glucoseverbruik en groeilimitatie. De pH werd namelijk al groeilimiterend nadat nog maar 60% van de toegediende saccharose omgezet werd tot melkzuur.
De nisinevorming startte nadat ongeveer 30% van de finale biomassa gevormd was. De hoogste nisinetiter stemde nagenoeg overeen met het tijdstip waarop de maximale biomassa bereikt werd. Op het einde van de exponentiële groeifase is een hoge nisineproduktiesnelheid vastgesteld.

Het batchfermentatieprofiel voor microbiële groei en nisineproduktie met L. lactis ssp. Lactis NIZO 22186 is te zien in figuur 1.

Figuur 1. Batchfermentatieprofiel van Lactococcus lactis ssp. Lactis NIZO 22186 bij vrije pH met 1% saccharose als koolstofbron. Droge celmassa CDM (g/l), 0; nisine-activiteit P (IU/ml),n; residuele saccharoseconcentratie S (g/l), ; pH, ¦ (De Vuyst, 1990).

4.1.2 Schijnbare trofofase/idiofase-kinetiek en pH-regulatie van de nisinebiosynthese
Het profiel te zien in figuur 1 vertoont schijnbaar twee fasen: een fase van snelle groei en geringe nisineproduktie, de trofofase, gevolgd door een fase van beperkte groei en actieve nisineproduktie, de idiofase. Zo'n tweefasig fermentatieprofiel is karakteristiek voor secundaire metabolieten. In principe start de vorming van secundaire metabolieten immers slechts op het einde van de actieve groeifase, op het moment dat bepaalde voedingsbestanddelen uitgeput raken, de groei gelimiteerd wordt en de specifieke groeisnelheid afneemt. Er zijn verschillende hypothesen om deze schijnbare trofofase-idiofase batchkinetiek van de nisinebiosynthese te verklaren, maar deze zijn niet zozeer van belang (De Vuyst, 1990).
Wat wel van belang is voor het gebruik van nisine, is de invloed van de pH op de biosynthese en zodoende de activiteit. Een limiterend pH-effect werd reeds eerder aangetoond in de produktie van het lantibioticum epidermine. Hoewel biomassavorming en nisineproduktie al vroeg in de fermentatie plaatsvonden, zie figuur 1, werden hoge nisineproduktieniveau's niet bereikt, dit vermoedelijk door de snelle pH-daling door melkzuuraccumulatie. Dit limiterende effect is nogmaals bevestigd aan de hand van vrije pH-fermentaties uitgevoerd met toenemende beginconcentraties saccharose waarvan de resultaten te zien zijn in tabel 2. Ondanks de toenemende saccharoseconcentraties kon, onder vrije pH-fermentaties, slechts een gemiddelde saccharoseconsumptie van rond de 7.1 g saccharose/l medium, een maximale biomassaopbrengst van 0.90 CDM/l medium en maximale nisinetiter van ongeveer 2000 IU nisine/ml medium bereikt worden. De pH bleek daarbij telkens de limiterende factor te zijn. Nadat ongeveer 60 à 70 procent van de toegediende saccharose omgezet werd tot melkzuur werden de cellen zodanig in hun activiteiten geremd dat geen nisineproduktie en zelfs geen verdere groei meer mogelijk waren. Onder pH-vrije fermentaties hadden initiële saccharoseconcentraties van meer dan 0.5-1.0% dan ook geen effect meer op de hoeveelheid nisine. Alleen onder pH-gecontroleerde omstandigheden werden wel hogere opbrengsten verkregen. Het pH-effect was dus duidelijk een groeilimiterend effect (De Vuyst, 1990).


Tabel 2. Invloed van de initiële saccharoseconcentratie op de groei van en nisineproduktie door Lactococcus lactis ssp. lactis NIZO 22186 in fermentaties met vrije pH-verloop. De fermentatieparameters werden bepaald na 24 h incubatie (De Vuyst, 1990).

Initieel saccharosegehalte (g/l)	Eind pH	Droge celmassa (g/l)	Nisine-activiteit (IU/ml)	Residueel saccharosegehalte (g/l)
0.0	6.60	0.16	390	0.0
5.0	4.40	0.85	1615	0.0
10.0	4.19	0.83	1808	3.3
20.0	4.19	0.85	1932	12.5
30.0	4.19	0.89	1947	22.8
50.0	4.19	0.95	2000	--
100.0	4.19	1.00	2028	--

Fermentatieprocessen uitgevoerd onder verschillende constante pH waarden bevestigen dat de nisineproduktie negatief beïnvloed wordt door deze pH. Uit dit onderzoek blijkt dat nisineproduktie nagenoeg optimaal doorgaat in het pH-gebied 5.0-6.8. Celgroei vindt optimaal plaats bij neutrale pH en in iets mindere mate bij hoge pH. Alkalische en zure omstandigheden zijn echter wel desastreus voor de nisineproduktie (De Vuyst, 1990). Uit dit voorgaande kan geconcludeerd worden dat de pH essentieel voor de toepassing van melkzuurbacteriën als conserveringsmiddel. In tabel 3 zijn de resultaten te zien van de invloed van de pH op groei en produktie.

Tabel 3. Invloed van de pH-waarde op microbiële groei en nisineproduktie tijdens Lactococcus lactis ssp. lactis NIZO 22186 pH-gecontroleerde fermentaties.

PH-stat-waarde	Lag-fase (h)	Specifieke groeisnelheid (h-1)	Droge masse (g/l)	Vol. nisine activiteit (IU/ml)	Specifieke nisine act. (mg/g)	Residueel saccharosegehalte (g/l)
8.00	5	0.45	2.44 1	18 2	0	1.3
6.80	3	0.48	3.40 3	2184 3	16	0.0
5.00	3	0.32	1.80 4	2310 4	32	3.8
4.10	-	-	0.14 5	86 5	15	19.6

1 17 h, 2 5.5 h, 3 9.5 h, 4 12 h, 5 24 h incubatie
- = sterk geïnhibeerde groei

.1.3 Invloed van verschillende koolstofbronnen op groei en nisineproduktie
Om de verschillende relevante invloeden op de groei van en de nisineproduktie door de Lactococcus lactis ssp. lactis NIZO 22186 te onderzoeken, is er ook gekeken naar het effect van de koolstofkatabolische regulatie in de fermentatie van nisine. Hiertoe werd in een standaard CM-medium saccharose vervangen door de te testen koolstofbron, waarbij o.a. werd gelet microbiële groeisnelheid (h -1) en de volumetrische nisineproduktie (IU nisine/ml medium). In aanwezigheid van de volgende suikers werd een aanzienlijke groei en nisineproduktie gevonden: glucose, fructose, galactose, ribose, saccharose, maltose, cellobiose en trehalose. Een overzicht van de resultaten van dit onderzoek zijn te vinden op bijlage II. De algemene conclusie is dat de nisine-activiteit hoger is in media met disaccharide als koolstofbron (De Vuyst, 1990).

4.1.4 Groei en nisineproduktie onder limitaties
Om de invloed van de verschillende limitaties te onderzoeken op de microbiële groei en nisineproduktie zijn er chemostaatfermentaties uitgevoerd, waardoor de het limiterende metabool onder vaste condities kon worden toegevoerd. Bij een continu cultuur fermentatieproces geldt immers dat de dilutiesnelheid (D) gelijk is aan de specifieke groeisnelheid (mu). De dilutiesnelheid kan beïnvloed worden door aanpassing van het toevoerdebiet F van het limiterende substraat.

- Koolstoflimitatie

Om een koolstoflimitatie te creëren werd de saccharoseconcentratie in het medium verlaagd (5x). Uit het fermentatieprofiel bleek dat de biomassa geleidelijk afnam bij stijgende dilutiesnelheden. De nisineproduktie was maximaal wanneer de bacteriën traag ontwikkelden en nihil wanneer ze snel tot ontwikkeling kwamen. De volumetrische nisine-activiteit was maximaal bij een dilutiesnelheid van 0.6 h -1 .

- Stikstoflimitatie

Om te bekijken of het verloop van de nisineproduktiviteit in functie van de dilutiesnelheid karakteristiek was voor de koolstoflimitatie of voor de microbiële groeisnelheid is dezelfde proef ook uitgevoerd onder stikstoflimitatie. Hiervoor geldt dat de volumetrische nisine-activiteit een optimum had bij een dilutiesnelheid bij 0.5 h-1. Het profiel was te vergelijken met deze onder koolstoflimitatie. Bij stijgende dilutiesnelheden was ook een afname in biomassa te zien.

- Fosfaatlimitatie

Ook bij fosfaatlimitatie neemt de biomassa drastisch af bij een dilutiesnelheid groter dan 0.8 h -1 . Een optimum was er ook weer te zien in de volumetrische nisineproduktie bij een D van 0.5 h -1 . Het optimum was wel kleiner dan deze was onder koolstof- of stikstoflimitatie.

In tabel 4 staat een vergelijkend overzicht van enkele karakteristieke parameters tijdens produktie onder limitaties (De Vuyst, 1990).


Tabel 4. Overzicht van de verschillende parameters, bepaald bij verschillende limitaties (De Vuyst, 1990).

Fermentatieparameter	Koolstoflimitatie	Stikstoflimitatie	Fosfaatlimitatie
mu max	1.2 h -1	1.0 h -1	1.0 h -1
D c	1.2 h -1	1.0 h -1	1.0 h -1
Dma x	0.6 h -1	0.5 h -1	0.5 h -1
Nip max 1	610 IU/ml	463 IU/ml	310 IU/ml
Yxp max	11.7 mg/g	9.0 mg/g	8.8 mg/g

1 Nip=nisineproduktie

4.2 Produktie van amylovorine
Voor de produktie van amylovorine werd gebruik gemaakt van de stam Lactobacillus amylovorus DCE 471. Aan hand van verschillende resultaten zijn hierbij modellen opgesteld om tot verdere voorspellingen te kunnen komen. Voor de groei van de micro-organismen is gebruik gemaakt van het bestaande model van Verhulst uit 1938, daarin wordt het dynamisch groei model als volgt beschreven:

dX/dt = mu max *X*(1-X/X max) (1)

waarin geldt: X = droge celmassaconcentratie (g l -1)
mu max = specifieke groeisnelheid (h -1)
X max = maximale celmassaconcentratie (g l -1)

Voor de glucoseconsumptie is gebruik gemaakt van het model van Pirt, het model van behoud van energie.

dS/dt = -1/Y x/s *dX/dt-m s *X (2)

waarin geldt: S = glucose concentratie (g l -1)
Y x/s = yield (g CDM (g glucose) -1)
m s = maintenance (g glucose (g CDM) -1 h -1)

Aangezien de Lactobacillus amylovorus DCE 471 homofermentatief is kon worden volstaan met het volgende model voor produktie voor melkzuur.

dLA/dt = -1/Y s/l *dS/dt (3)

waarin geldt: LA = melkzuur concentratie (g l -1)
Y s/l = yield voor melkzuurproduktie (g glucose (g LA) –1) (=1 g g -1)

De bacteriocineproduktie wordt beschreven door het volgende model:

dB/dt = k b *dX/dt als geldt X < X' (4a)
dB/dt = -k'*B als geldt X > X' of S = 0 (4b)

waarin geldt: B = bacteriocine titer (IU l -1)
k b = specifieke bacteriocine produktie constante (IU (g CDM) –1)
k' = specifieke bacteriocine degradatie constante (h -1)
X' = X waarbij de bacteriocine produktie afneemt

De verschillende parameters zijn allen bepaald bij verschillende temperaturen. Een overzicht is te zien in tabel 5 (Lejeune et al , 1998)

Tabel 5. Verschillende parameters voor groei en produktie van amylovorine door de Lactobacillus amylovorus DCE 471 bij verschillende temperaturen (Lejeune et al , 1998).

Parameter	30°C	37°C	45°C	30°C*	30°C†	37°C‡
Groei
mu max	0.22	0.64	0.90	0.22	0.22	0.40
X max	2.0	2.6	2.0	2.0	2.0	2.1
Glucose metabolisme
Y x/s	0.17	0.20	0.16	0.17	0.17	0.20
m s	0.4	0.9	1.1	0.4	0.4	0.9
Bacteriocine produktie
k b	5000	3500	4000	10000	7000	3500
X'	1.0	1.9	0.9	1.1	n.d.	0.9
k'	0.4	0.4	0.4	0.4	n.d.	0.4

*=parameters gebruikt bij de periode van 30°C in het experiment met een enkele temperatuurshift.
†=gebruikt in het eerst deel van de dubbele temperatuurshift en ‡=gebruikt in het tweede deel van het experiment met een dubbele temperatuurshift.

5. BIOCONSERVERING DOOR IN-SITU GEPRODUCEERDE BACTERIOCINES

Melkzuurbacteriën zijn een diverse bacteriegroep die een rol spelen in verschillende soorten voedsel; een opsomming van voedsel en de bijbehorende melkzuurbacterie is te zien in bijlage III (Stiles, 1996). Ze worden gezien als ongevaarlijk of soms zelfs als goed voor het menselijk lichaam, zoals probiotica. Deze melkzuurbacteriën bioconserveren het voedsel vaak door de lage pH, verkregen door de produktie van een zuur (Stiles, 1996), (Friedman, 23/1/99).
Er zijn al vele gevallen bekend, waarbij melkzuurbacteriën gebruikt worden als bioconservering. Naast de al eerder genoemde melk- en vleesprodukten, liggen er ook mogelijkheben voor het gebruik in de visprodukten. Hierbij wordt voornamelijk gebruik gemaakt van melkzuurbacteriën die de vissen eigen zijn. Aangetoond is dat ook deze bacteriën bacteriocines produceren (Einarsson en Lauzon, 1995).
Ook bacteriocines kunnen gebruikt worden als bioconservering, zowel als additief, maar misschien door in-situ produktie. Het gebruik maken van in-situ -geproduceerde bacteriocines als bioconservering is een aspect wat nog veel problemen met zich meebrengt.
Heel veel factoren beïnvloeden de werkzaamheid van de bacteriocines of van de melkzuurbacteriën die de bacteriocines produceren. Factoren zoals verlies aan activiteit van de bacteriocines, verlies aan produktiecapaciteit van de melkzuurbacterie, inhibitie door bacteriofagen, antagonisme van ander bacteriën, mogelijke ontwikkeling van resistente microflora en inactivatie door enzymen of binding van de bacteriocines (Stiles, 1996).
Essentieel voor het gebruik van in-situ-geproduceerde-bacteriocines als bioconserveringsmiddel is de hoeveelheid nodig voor een aanzienlijke afdoding. Onderzoek heeft aangetoond dat er een reductie optrad van 10 3 tot 10 7 bij contact met 50 ug nisine (=2000 IU) en 20 mM EDTA voor een uur. EDTA breekt de celwand af, waardoor ook sommige Gram-negatieve micro-organismen gevoelig zijn voor nisine (Stiles, 1996).

5.1 Bioconservering in melkprodukten
Voor een optimale conservering door melkzuurbacteriën zijn er een drietal condities belangrijk. Het aanwezig zijn van voldoende fermenteerbare suikers, een lagere zuurstofconcentratie tijdens het fermentatieproces en tijdens de opslag van het produkt en een snelle groei van de melkzuurbacterie en voldoende aanmaak van melkzuur (Friedman, 23/1/99). Bacteriocines worden al geregeld toegepast in startercultures van verschillende kaassoorten (Hugenholtz et al .,1991; Ross et al ., 1999).

5.2 Bioconservering in vleesprodukten
Voor succesvolle conservering van vlees met melkzuurbacteriën gelden weer andere voorwaarden: een lage pH, een aanzienlijke hoeveelheid van niet-gedissocieerde organische zuur-moleculen, buffercapaciteit van het substraat, waterstofperoxide en produktie van antibiotica of bacteriocines (Friedman, 23/1/99).
Bij vlees komen meer problemen kijken. In vlees binden de bacteriocines makkelijk met de aanwezige fosfolipiden wat de activiteit belemmert. Hierdoor is er ook veel nodig aan bacteriocines om een aanzienlijke langere houdbaarheid te krijgen. Ook is de oplosbaarheid van nisine bij de pH van verschillende vleessoorten te laag (Stiles en Hastings, 1991).
Daardoor is er een grotere hoeveelheid nisine nodig om een voldoende afdoding te verkrijgen; in combinatie met nitriet daarentegen werd wel een duidelijk verlengde houdbaarheid bereikt (Stiles, 1991). In combinatie met andere conserveringsmethode blijkt dit dus goed te werken. Dit was al eerder gevonden door Leistner. In Leistner's “hurdle technology for preservation” combineerde hij de effecten van wateractiviteit, pH, temperatuur en conserveringsmiddelen met bacteriocines en/of melkzuurbacteriën, die bacteriocines konden produceren. (Leistner, 1992).
Een ander belangrijk punt is dat de melkzuurbacterie moet kunnen groeien en produceren bij lage temperaturen, waarbij het vlees bewaard wordt (Stiles en Hastings, 1991).
Alhoewel er nog veel beperkingen zijn aan de toepassing van bacteriocines en bacteriocine-producerende melkzuurbacteriën, liggen er toch mogelijkheden voor de toekomst (Stiles, 1996).

6. CONCLUSIE

Uit voorgaand literatuuronderzoek is gebleken dat het op zich mogelijk moet zijn om in-situ -produktie van bacteriocines toe te passen als bioconserveringsmethode. Dit wordt geconcludeerd uit het feit dat zowel de stabiliteit als de produktie voldoende is voor een gewenste afdoding van Gram-positieve bacteriën. Toch zal het zeer moeilijk worden om het te gebruiken als conserveringsmethode op zich. Er liggen betere kansen om het toe te passen met andere conserveringsmethoden.
In voedingsmiddelen heersen er andere omstandigheden die van invloed zijn op de bacteriocines. Al deze omstandigheden kunnen de activiteit of de produktie beïnvloeden, waardoor er andere waarden en parameters gelden. Aangezien er gewerkt wordt met een produkt bestemd voor consumptie, komen er heel veel eisen bij kijken voordat het veilig toegepast kan worden. Nisine wordt al toegepast en is zodoende al een ingrediënt. Maar andere bacteriocines en het gebruik van in-situ produktie moet eerst in wetten toegestaan worden.
Veel onderzoek is dus nog gewenst voordat het een ingeburgerd gebruik is, maar er liggen zeker mogelijkheden op dit gebied.

LITERATUURLIJST

1. Friedman, Y. (1996) Lactic acid bacteria as Food Preservatives. dna2z.com/projects/lactic.html op 23 januari 1999.
2. Stiles, M.E. (1996) Biopreservation by lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek 70 , 331-345.
3. Klaenhammer, T.R. (1988) Bacteriocins of lactic acid bacteria. Biochimie 70 , 337-349.
4. Abee, T. (1998) Bioconservering. Fermentatie van levensmiddelen 1-8.
5. Hugenholtz, J., Kuipers, O.P. en Rollema, H.S. (1991) Nisine: een natuurlijk conserveermiddel. VMT 21 , 19-22.
6. Stiles, M.E. en Hastings J.W. (1991) Bacteriocin production by lactic acid bacteria: potential for use in meat preservation. Trends in Food Science & Technology Oct ., 247-251.
7. De Vuyst, L. en Vandamme, E.J. (1990) Biosynthese, fermentatie en genetica van het Lactococcus Lactis ssp. Lactis lantibioticum, nisine .
8. Van 't Riet, K en Tramper, J. (1991) Basic Bioreactor Design . New York: Marcel Dekker, INC.
9. Lejeune, R., Callewaert, R., Crabbe, K. en De Vuyst, L. (1998) Modelling the growth and bacteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE 471 in batch cultivation. Journal of Applied Microbiology 84 , 159-168.
10. Einarsson, H. en Lauzon, H.L. (1995) Biopreservation of brined shrimp (Pandalus borealis ) by bacteriocins from lactic acid bacteria. Applied Environmental Microbiology 61 , 669-676.
11. Leistner, L. (1992) Food preservation by combined methods. Food Research International 25 , 151-158.

Bijlage I:

Enkele voorbeelden van melkzuurbacteriën en hun bacteriocines (Abee, 1998).

Melkzuurbacterie	Bacteriocine
Lactobacillus acidophilus C-7	Lactacine M
Lactobacillus acidophilus 88	Lactacine F
Lactobacillus acidophilus 11759	Lactacine B
Lactobacillus acidophilus ADH	Lactacine B
Lactobacillus helveticus 481	Helveticine J
Lactobacillus plantarum C-11	Plantaricine A
Lactobacillus sp. C-136	s.n.
Lactobacillus sp. UAL 11	s.n.
Lactococcus lactis ATCC 11454	Nisine
Lactococcus lactis SIK83	Nisine
Leuconostoc sp. UAL14	s.n.
Pediococcus acidilactici PAC 1.0	Pediocine PA-1
Pediococcus pentosaceus FBB 61-1	Pediocine A
Pediococcus pentosaceus L-7230	Pediocine A

Bijlage II:

Invloed van verschillende koolstofbronnen op de groei en nisineproduktie (De Vuyst, 1990).

Bijlage III:

Voedsel en de bijbehorende melkzuurbacterie (Stiles, 1996).